第一百一十期 Discovery整合化層析應(yīng)用案例分享

2018年08月20日source：管理員

很多藥企做細胞株篩選，或者抗體糖型的培養(yǎng)工藝調(diào)節(jié)，搖瓶培養(yǎng)的數(shù)量都是非常大的，需要進行一系列的平行實驗、對比實驗，等到樣品收獲時，給下游純化人員所造成的純化壓力也是巨大的。經(jīng)常聽到有人抱怨：領(lǐng)導(dǎo)一直催著完成純化，需要送檢看結(jié)果，可是再催，純化步驟也還得一步一步來，那么多樣品，怎么可能在短時間內(nèi)完成所有純化？

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??其實，已有設(shè)備生產(chǎn)企業(yè)意識到了這一點，而且已經(jīng)研發(fā)出整合化層析技術(shù)來應(yīng)對這一難題。整合化層析，即將多步層析整合為一步，從而縮短純化時間，提高純化效率，這種技術(shù)是否真能起到作用呢？今天，小編就與各位分享一下該技術(shù)的應(yīng)用案例，跟大家一探究竟。

1）Protein A - Desalting

第一步：Protein A，1?mL預(yù)裝柱

第二步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱

方法信息
純化步驟	Protein A?- Desalting
第一步?– Protein A
Buffer A –?平衡液	25?mM?PB, 150mM NaCl, pH 7.4
Buffer B –?洗脫液	100mM citrate, pH 3.5
Buffer C –?NaOH	0.1?M?NaOH
樣品上清液	10?mL CHO單抗上清液，濃度1.0 mg/mL
第二步–?Desalting
Buffer D –?平衡液	25?mM?PB, pH 7.4

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??層析過程圖譜：

??在該過程中，Protein A的洗脫組分不經(jīng)過收集，而是在系統(tǒng)內(nèi)直接上樣至脫鹽柱，兩步層析整合為一步，從而提高了純化效率。

??最終產(chǎn)品經(jīng)SE-HPLC檢測，單體純度為96.5%，可直接用于其它常規(guī)檢測

結(jié)果匯總
產(chǎn)品濃度	3.7 mg/mL
產(chǎn)量	9.92 mg
單體含量	96.5%
聚集體含量	3.2%

2）IMAC - Desalting

第一步：IMAC，1?mL預(yù)裝柱Chelate (Cu²⁺)

第二步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱

方法信息
純化步驟	IMAC - Desalting
第一步?–?IMAC
Buffer A –?平衡液	25?mM?PB, 0.5?M NaCl, 10?mM imidazole, pH 7.5
Buffer B –?洗脫液	25?mM?PB, 0.5?M NaCl, 0.5?M imidazole, pH 7.5
Buffer C –?NaOH	0.1?M?NaOH
樣品上清液	5?mL E. coli BL21(DE3)細胞裂解液，過量表達20 kDa?His6-UCB9 (濃度0.5mg/mL)
第二步–?Desalting
Buffer D –?平衡液	1x PBS, pH 7.4

??層析過程圖譜：

??在該過程中，IMAC的洗脫組分同樣直接上樣至脫鹽柱，節(jié)省了純化時間。

??最終產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE及SE-HPLC檢測，單體純度為98.1%，可直接用于其它常規(guī)檢測。

結(jié)果匯總
產(chǎn)品濃度	1.1?mg/mL
產(chǎn)量	2.3?mg
單體含量	98.1%
聚集體含量	1.9%

3）Protein A - CIEX - Desalting

第一步：Protein A，1?mL預(yù)裝柱

第二步：CIEX，5 mL預(yù)裝柱（SP）

第三步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱

方法信息
純化步驟	Protein A?-?CIEX?- Desalting
第一步?– Protein A
Buffer A –?平衡液	25?mM?PB, 150mM NaCl, pH 7.0
Buffer B –?洗脫液	100mM citrate, pH 3.5
Buffer C –?NaOH	0.1?M?NaOH
樣品上清液	10?mL CHO單抗上清液，濃度1.0 mg/mL
第二步?–?CIEX
Buffer?D–?平衡液	25?mM?PB, pH?6.0
Buffer?E?–?洗脫液	25?mM?PB,?0.5 M NaCl,?pH?6.0
Buffer C –?NaOH	0.1?M?NaOH
第三步?–?Desalting
Buffer?F?–?平衡液	25?mM?PB, pH 7.0

??層析過程圖譜：

??在該過程中，Protein A的洗脫組分經(jīng)過在線稀釋，直接上樣至CIEX層析柱，CIEX進行線性洗脫，去除降解物及聚集體，將目標組分直接上樣至脫鹽柱。三步層析緊密銜接，前一步層析的洗脫與后一步層析的上樣同時進行，使得純化效率顯著提高。

??最終產(chǎn)品經(jīng)SE-HPLC檢測，純度高達99.5%，二聚體含量僅為0.5%，比Protein A - Desalting兩步層析所得產(chǎn)品的二聚體含量降低近6倍，該產(chǎn)品可直接用于氨基酸序列測定、二硫鍵測定以及糖型分析等高純度要求的檢測。

結(jié)果匯總
產(chǎn)品濃度	0.91?mg/mL
產(chǎn)量	6.7?mg
單體含量	99.5%
聚集體含量	0.5%

4）高通量（HT）純化應(yīng)用

??將Discovery系統(tǒng)額外擴展出35個入口用于上樣，即實現(xiàn)整合化層析的高通量純化應(yīng)用。通過Discovery Wizard，可將每個入口的上樣體積、流速等信息預(yù)先設(shè)定，即可實現(xiàn)高通量自動化操作。
??采用Protein A - CIEX - Desalting三步向?qū)K，每次上樣10 mL單抗上清液（1.0 mg/mL），每次產(chǎn)量均≥6.5 mg。單個樣品的純化耗時約為74 min，在24 h內(nèi)純化出多達19個樣品！而且該時間包含了層析柱的清洗環(huán)節(jié)。該系統(tǒng)持續(xù)運行5天，純化樣品總數(shù)量高達91個。

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